酶作为一种生物催化剂，能够通过降低从底物到产物的反应活化能，在温和环境条件下提高反应速度^[1-2]，因为酶具有催化高效性、底物专一性等优势，使其在食品、工业、医药、分子生物学等领域具有越来越广泛的应用^[3-4]。目前在食品工业中开发利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶^[5]、菠萝蛋白酶^[6-8]、无花果蛋白酶^[9-11]以及相对研究较晚较弱的生姜蛋白酶^[12-13]等，这些植物蛋白酶结构与性质均相似。生姜酶活测定常参照木瓜蛋白酶活性测定标准，但实际试验中因生姜蛋白酶与木瓜蛋白酶并非完全相同，具体反应温度、时间等条件尚不统一，不能完全参照木瓜蛋白酶标准进行测定^[14]。近年来关于生姜蛋白酶的研究虽多有报道，但生姜酶活性具体测定条件尚未统一。宋琦等^[13]以酪蛋白为底物，单位时间内以生姜蛋白酶分解酪蛋白的生成物的量来表示酶活大小，此过程以需要加三氯乙酸等强酸终止反应；周慧等^[15]采用考马斯亮蓝法测定单位时间内生姜蛋白酶分解酪蛋白后溶液残留蛋白，以此为指标确定酶活大小，但此方法受溶液中杂质影响较大，所测结果真实性有待考究；于洁等^[16]以加热生姜蛋白酶失活后样液为对照，以考马斯亮蓝法直接测出蛋白酶活性，但具体工艺条件有待筛选。因此建立快速、准确的生姜酶活测定方法非常重要。介于响应面试验^[17-19]周期短，回归方程精确度高，能研究多因素间交互作用等优点^[20-23]，本实验以生姜蛋白酶活性为指标，通过单因素试验，筛选出主要影响因素，再进行响应面实验设计，从而优化了生姜蛋白酶活性测定工艺条件，为后续姜酶提取、纯化提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

生姜蛋白酶：实验室提取；干酪素：天津市博迪化工有限公司；半胱氨酸：北京索莱宝有限公司；BSA（牛血清白蛋白：北京索莱宝有限公司；考马斯亮蓝G-250：天津市凯通化学试剂有限公司提供；三氯乙酸：天津市博迪化工有限公司；其他试剂均为实验室常规试剂。

1.2 试验仪器

UV-5500型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；数显恒温水浴锅HH-4：上海梅香仪器有限公司；离心机TDL-40B：上海安亭科学仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1 生姜蛋白酶的制备

生姜洗净切碎，称取200g，按1：3料液比打浆，低温（4℃）静置2h，离心取沉淀用磷酸缓冲液1:4复溶，低速搅拌15min后再静置3h，用四层纱布过滤后离心取上清液，加95%的乙醇至醇体积为60%，冰浴7小时离心取沉淀^[24]。

1.3.2蛋白质含量的测定

本实验采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量^[25]。标准曲线为：y=0.0193x-0.0187，R²=0.9994，其中，x：蛋白质浓度，μg/mL  y：吸光度值  

1.3.3 生姜蛋白酶酶活力测定

生姜蛋白酶酶活测定条件：40℃水浴条件下，酶促反应15min降解酪蛋白产生TCA可溶的多肽增加量，以灭活的生姜蛋白酶为对照^[22]，根据酪氨酸标准曲线，测得样品中酶活力大小。酶活力标准曲线为：y=774.11x-8.5901，R²=0.999，其中，x：样品吸光度   y：酶活力，U

1.3.4  生姜蛋白酶酶活测定单因素试验

生姜蛋白酶活性测定各单因素梯度设置：反应温度20、30、40、50、60、70℃；反应时间1、3、5、7、9、11min；酪蛋白底物浓度0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8%；磷酸盐缓冲液pH5、5.5、6、6.5、7、7.5。

1.3.5 响应面法优化提取条件

在单因素的基础上采用Design-Expert 8.0.6 软件进行四因素三水平试验设计，以生姜蛋白酶酶活为响应值进行回归分析，建立二次回归模型，拟合得到二次回归方程。