姜黄素（Cur）1,7-双（4-羟基-5-甲氧基苯基）-1,6庚二烯-3,5-二酮（二糠基甲烷），是一类从姜黄根茎中分离出的天然产物（姜黄），该草药已被广泛应用在中国和南亚[3-5]。姜黄是姜科植物，其根茎可入药，气香特异，味苦、辛，性温，归脾、肝经；具有破血行气、通经止痛功能，用于胸胁刺痛、胸痹心痛、痛经经闭、癥瘕、风湿肩臂疼痛、跌扑肿痛[6]。姜黄素是具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面药理作用。研究显示Cur减轻脑、肾、视网膜、肝脏、和结肠的缺血再灌注损伤[7-10]。有相关研究报道姜黄素后处理通过激活预存活信号通路减轻IR损伤[9,11]。沉默信息调节因子3（SIRT3）[12-16]在肿瘤、炎症、卡路里限制延长寿命及心肌肥厚等方面有相关研究，其对抗氧化应激从而发挥保护作用，但是姜黄素能否通过SIRT3保护心肌细胞缺血再灌注损伤目前仍缺乏相关研究。因此，本研究旨在探讨姜黄素预处理心肌细胞缺血再灌注损伤模型，拟观察姜黄素对IRI的保护作用及SIRT3所介导的相关机制。
1.材料与方法
1.1材料
姜黄素、MTT (美国Sigma公司)； Bcl2, Bax，Sirt3，β-actin抗体（美国Santa Cruz公司）；3-TYP（由重庆大学IDRC创新药物研究中心合成）；二抗（北京中山科技有限公司）；TUNEL试剂盒（德国Mannheim公司）. MDA，SOD，GSH试剂盒（南京建成生物科技有限公司）.
1.2方法
1.2.1选择姜黄素浓度及细胞培养与处理
将心肌细胞随机分为对照组、缺血组和Cur（2.5,5,10μM）组（n = 8）。还比较了0.1和100μMCur对H9C2的影响。 MTT结果表明，0.1μMCur对细胞活力的改善几乎没有影响（vs IR组，P> 0.05），而100μM的Cur对提高细胞活力的影响不如10μM的效果好（P <0.05））。然而，比较5μM和10μM的作用（P <0.05）。结果，选择5μMCur用于本研究。
H9C2在补充有10％胎牛血清，2mML-谷氨酰胺，100U / mL青霉素和100g/ mL链霉素的DMEM培养基（Hyclone，UT，USA）中，在37℃，5％CO 2和95％空气中培养。在DMSO中制备姜黄素储备溶液，并在实验之前立即用培养基稀释。 DMSO（0.01％）用作对照组。在进行处理后，获取细胞用于进一步分析。
1.2.2细胞存活率测定
通过MTT实验方法评估H9C2心肌细胞活力。预处理的细胞用PBS洗涤后，加入100μL 0.5mg / mLMTT溶于无酚红DMEM中的溶液，37℃孵育4h。使用分光光度计（SpectraMax 190，Molecular Device，USA）在490nm测定结果，细胞存活率通过光密度（OD）值表达。
1.2.3细胞凋亡实验
通过使用原位细胞死亡检测试剂盒进行TUNEL测定来分析细胞凋亡。根据制造商的说明书使用双染色技术。将H9C2在4％多聚甲醛中固定24小时后，进行TUNEL测定以染色凋亡细胞的细胞核（绿色），并使用4'6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色所有核（蓝色）。凋亡指数表示为阳性染色的凋亡H9C2的数目/ H9C2的总数×100％。
1.2.4细胞内SOD，GSH-Px和MDA浓度测定
如前所述[38]，使用试剂盒测定细胞内SOD，GSH-Px和MDA的活性。所有实验完全按制造商的说明书进行。酶活性表示为每毫克蛋白质的单位。用于测量SOD活性的测定基于SOD抑制由黄嘌呤 - 黄嘌呤氧化酶系统产生的O2-氧化羟胺的能力。一个单位的SOD活性定义为在550nm处吸光度降低50％的量。通过定量由催化的还原型谷胱甘肽氧化的谷胱甘肽被H2O2氧化的速率来进行测量GSH-Px活性的测定。一个单位的GSH-Px定义为在1min/ mg蛋白质中在412nm下将GSH的水平降低1μM的量。通过其与硫代巴比妥酸的反应在532nm测量MDA，以形成稳定的发色产物。 MDA水平表示为纳摩尔/毫克蛋白质。
1.2.5心肌细胞的制备和模拟缺血再灌注（SIR）治疗
使用先前报道的方法H9C2的原代培养物培养[20]。简言之，将心肌细胞暴露于含有以下试剂的缺血缓冲液（mM）：NacI（137），KCl（12），Mgcl2（0.49），CaCl2·2H2O（0.9）和Hepes（4）。该缓冲液还补充有以下化合物（mM）：脱氧葡萄糖（10），连二硫酸钠（0.75）和乳酸盐（20）。缓冲液pH为6.5，并将细胞在潮湿的细胞培养箱（21％O2，5％CO2，37℃）中孵育1.5小时。在正常空气和培养基条件下再灌注4小时。
1.2.6蛋白质印迹分析
将H9C2样品在含有50mmol / L Tris-HCl（pH 7.3），150mmol / L Nacl，5mmol / L EDTA，1mmol / L二硫苏糖醇，1％Triton X-100和1％蛋白酶的裂解缓冲液抑制剂混合物中。将12,000g裂解物离心15分钟，得到的上清液转移至新管中并在-70℃下储存。使用Bradford蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度，并通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质并转移至硝酸纤维素膜。将膜在含有5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水和吐温20（TBST，pH 7.6）中封闭1小时，然后在4℃下用针对SIRT3（1：500稀释），Bcl2，Bax， SOD2和β-actin（1:1000稀释）抗体中孵育过夜。印迹用TBST洗涤。然后在室温下用合适的第二抗体（1:5000稀释）探测膜90分钟，并用TBST洗涤。通过化学发光检测蛋白质条带并用Quantity One软件包（West Berkeley，CA，USA）测定。对照组的结果定义为100％。
