孵化酶（hatching enzyme ）具有特异性降解卵膜的功能，广泛存在于家蚕（吴俊 2012）、海胆（Roe J L et al 1990）、对虾（赵君，2007）、鱼类（史振平等 2008，罗颖 2010）等动物的胚胎中。鱼类的孵化酶被认为可能与鱼类基因转移、核移植等相关遗传工程有关（刘军等 2003），由高卵壳裂解酶（High Choriolytic Enzyme , HCE）和低卵壳裂解酶（Low Choriolytic Enzyme , LCE）两种成分组成，是由鱼类的孵化腺细胞分泌而来，其中HCE先于LCE被分泌出来。（Yasumasu S et al. 1994， Yasumasu S et al. 1994）在HCE和LCE的共同作用下使鱼类胚胎的卵膜被降解（胡先成 2007）。黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）人工繁殖过程中水霉病频发，给养殖户带来了难以估量的经济损失。亚甲基蓝，又名碱性湖蓝、次甲基蓝、美蓝等，呈深绿色有光泽的颗粒状或粉状结晶，具碱性，其水溶液呈蓝色，是一种常见的工业染料，也是印染业废水中的主要成分之一。近年来，在孔雀石绿被禁用后，亚甲基蓝常被用于防治鱼卵水霉病（刘富强 2009）。但是有研究发现亚甲基蓝及代谢物有致畸、致突变作用，在日本、美国等国并未允许其用于水产养殖（范克伟 2009，宫向红等 2012）。虽然我国尚未将亚甲基蓝列为禁用药物，但是其对于鱼类潜在的安全性威胁亟待研究。本实验从HCE的角度入手，采用免疫组织化学方法评价了亚甲基蓝对孵化酶在蛋白水平相对表达量的影响，为评估亚甲基蓝在鱼卵孵化过程中的潜在风险提供依据。

 材料与方法

1  实验材料

黄颡鱼受精卵由湖南省岳阳市华容县田家湖渔业科技有限公司惠赠，受精后立即用黄泥脱粘放入孵化桶中，室内恒温流水孵化，孵化温度（25 ± 0.5）℃，pH 7.4左右。

2  主要试剂

EDTA 抗原修复液、PBS缓冲液（0.01 mol/L）、Harris苏木素染液购自广州晶泉生物有限公司，BSA购自Sigma公司。鱼卵孵化酶一抗由上海佑隆生物科技有限公司合成，免疫组化试剂盒DAB（二氨基联苯胺，3，3’-diaminobenzidine）显色剂、羊抗兔二抗购自DAKO公司。

 鱼卵高卵壳裂解酶（HCE）一抗制备方法 

根据日本青鳉鱼（Oryzias latipes）HCE蛋白质序列（序列号：NP_001098293.1）设计2条多肽链作为免疫原，分别为LLEGDLVAPTNRNA（14）和TPYDYSSIMHYGRD（14），多肽链由上海佑隆生物科技有限公司合成；将偶联后的多肽-BSA与等体积的福氏佐剂混合乳化均匀，成油包水状态后分别皮下注射到取2只新西兰大白兔，免疫3次后，取血清经ELISA检测，抗血清效价不低于1:50 000；（这里的1：50000是最后一次免疫后血清的效价，并非做实验（WB等）的效价）将收集到的抗血清经硫酸铵纯化，得到鱼卵孵化酶（HCE）兔多克隆抗体。

1.3  实验方法

1.3.1  鱼卵处理

参考亚甲基蓝防治鱼卵水霉病的用法与用量，将受精后的黄颡鱼卵立即放入15 mg/L亚甲基蓝中浸泡30 min，清洗数次，无损伤转移至清水中。同时设不做任何处理的空白对照组，试验组使用400枚黄颡鱼鱼卵，空白对照组使用500枚。孵化条件同1.1。

1.3.2 鱼卵采集与组织切片

分别在受精后0、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h取实验组及空白对照组黄颡鱼鱼卵50枚，用PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）稍稍清洗并吸干水分后，迅速将鱼卵放入4%多聚甲醛溶液中，固定24 h后转移至75%酒精中保存。将固定好的鱼卵经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为5 µm。将包含有组织的蜡块粘附于APES粘片剂处理的载玻片上，放在40℃烘箱中烘干2 h后，放在玻片盒中备用。

1.3.3 免疫组织化学染色

将1.3.2中烘干后的载玻片经以下步骤进行免疫组织化学染色：（1）石蜡玻片脱蜡至水，用PBS缓冲液（0.01 mol/L，pH 7.4）冲洗3次，每次3 min；（2）将组织玻片置于盛满EDTA 抗原修复缓冲液（pH 9.0）的修复盒中，置于微波炉内进行抗原修复。自然冷却后将粘附了组织的玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5 min；（3）将附有组织的玻片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，再将此附有组织的玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min；（4）将玻片稍甩干后用免疫组化笔（可划出的耐热、疏水的分界线，保证试剂在被画圈内不易流失，避免发生试剂混杂）在组织周围画圈，在圈内滴加用5% BSA按1︰100比例稀释过的一抗覆盖组织，玻片平放于湿盒内4℃孵育过夜，阴性对照组不加入一抗；（5）将附有组织的玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。玻片稍甩干后在圈内滴加经辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记过的羊抗兔二抗覆盖组织，室温孵育50 min；（6）将附有组织的玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3 次，每次5 min，稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗玻片终止显色；（7）Harris-苏木素复染3 min 左右，用自来水冲洗，1%的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；（8）将附有组织的玻片经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。

1.4  光密度分析

在NIKON倒置显微镜下观察切片，分别随机挑选2张每个不同采样时间的亚甲基蓝处理组和空白对照组中的玻片，在200倍视野下进行拍照。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。使用Image-Pro Plus6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（Integrated Option Density, IOD)。

1.5  数据的统计学分析

用SPSS 16.0统计软件对各组切片的IOD进行单因素方差分析，以P< 0.01为差异极显著，0.01 <P < 0.05为差异显著，P > 0.05为差异不显著，数据以平均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示。