余甘（Phyllanthus emblic L.）是一种典型的热带果树，大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus），是中国及印度传统的药食两用水果，民间有人将余甘鲜叶冲茶而饮，余甘果实则可鲜食或被做成蜜饯、果汁等成品。余甘果实中含有丰富的维生素C、多酚、多糖等多种药效成分。近年来人们开始重视研究多糖的生物学功能，并有了一些重大发现，如当归多糖[1]、海带多糖[2]的护肝作用，猴头菌多糖[3]、石斛兰多糖[4]的抗氧化作用，黄连多糖[5]的降血糖作用，甘草多糖[6]、火棘多糖[7]的免疫调节作用等。而余甘多糖也具有抗氧化及抑制肿瘤细胞增殖[8]、调节机体免疫力[9]等功能，具有重大的研究价值。
植物多糖的生物活性通常都与其结构有着直接或间接的关系，某些天然植物多糖具有粘度较高、溶解性较差等特点，扩散力受到限制从而影响了其生物活性的发挥。多糖的结构修饰是指利用物理、化学或是生物的方法改变多糖的结构，进而改善其溶解性、扩散力，提高原有的生物活性，甚至会增加新的生物活性[10]。目前已有多种多糖结构修饰方法，其中羧甲基化修饰以其操作方法简单，过程易于控制，改性后的多糖活性有所提高且产物没有毒性而成为一种重要的修饰方法[11]。目前已有报道，羧甲基化后的苦豆子多糖及大粒车前子多糖的生物活性均有所提高[12, 13]，水不溶性的虎奶多糖经羧甲基修饰后，增加了水溶性，并且具有了抗HSV-2病毒的活性[14]，香菇多糖经羧甲基化后则增强了其对小鼠肿瘤细胞SP-2增殖的抑制作用[15]，金樱子多糖本身对肿瘤细胞基本没有活性，而羧甲基化修饰后，表现出呈剂量依赖性的抗肿瘤特性，尤其对人肝癌细胞HepG-2具有很强的抑制活性（50μg/mL时抑制率为87.8%）[16]。
我们先前的研究表明余甘多糖（EPS）含量高，占果实干重的10.33%，其化学组成及摩尔比为GalA（3.21）、Gal（6.59）、Rha（1）、Ara（0.23）、Xyl（0.30）、Glc（0.35）、Man（0.008）[17]。余甘多糖具有抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫等生物活性，但我们的研究发现EPS粘度较高，溶解性也较差，限制了其生物活性的发挥和发现，目前未见对其进行结构修饰的报道，本实验采用氢氧化钠-异丙醇-氯乙酸钠反应体系对EPS进行羧甲基化修饰，获得羧甲基化余甘多糖（CM-EPS），然后用羟基乙酸标准曲线法测定羧甲基取代度（DS），并用红外光谱对其结构进行表征，比较羧甲基化前后余甘多糖对DPPH、ABTS自由基，NO2-的清除作用及对HepG-2细胞增殖的抑制作用，研究羧甲基化修饰对余甘多糖生物活性的影响。

2 材料、试剂及仪器
2.1 材料
新鲜的余甘果实于2013年12月份采自福建省泉州市惠安县紫山镇蓝田村，品种为“粉甘”。挑选无病虫害的果实清洗、晾干、去核、冻干、粉碎、过40目筛，置于-40℃冰箱中备用。
2.2 主要试剂及仪器
试剂 氯仿、正丁醇、异丙醇、DPPH（2,2-dipheny-1-picryl hydrazyl）和ABTS（2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic Acid）（美国Simga公司）、2,7-二羟基奈、羟基乙酸、高硫酸钾、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、氯乙酸钠和MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基唑嗅盐）（北京索莱宝科技有限公司）、其他均为国产分析纯，改良型RPMI-1640培养基和DMEM低糖培养基（添加10%胎牛血清、1%双抗）（赛默飞世尔生物化学制品）、0.25%胰蛋白酶、抗坏血酸、溴化钾。
仪器及其他用品 紫外/可见分光光度计（U-2900，Hitachi公司，日本）、离心机（5810R，德国Eppendorf公司）、AVATAR 360型傅立叶变换换红外光谱仪（美国NICOLET公司）、酶联免疫检测仪（iMark，BIO-RAD公司）、CO2培养箱（BPN-150CRH，昆山一恒仪器有限公司）、BDS 300PH倒置生物显微镜及SMART数码生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、HepG-2细胞由中山大学提供。

3 实验方法
3.1羧甲基化余甘多糖的制备
参照李永裕[18]的方法，制得余甘粗多糖后冻融分级、30%H2O2脱色素、Sevage法除蛋白、透析，冻干制得余甘多糖(EPS)。
参照申林卉[12]的方法制得羧甲基化余甘多糖（CM-EPS），置于-40℃冰箱中备用。
红外光谱分析：分别取1mg EPS和CM-EPS，KBr压片，在4000-400cm-1范围内进行红外光谱扫描。
3.1.1羧甲基化余甘多糖溶解度和取代度的测定
羧甲基取代度（DS）测定：参考Eyler[19]的方法测定，以样品空白为对照，测OD520，用羟基乙酸（在氯化钙中干燥过夜）代替多糖做标准曲线，根据标准曲线计算每克样品中羟基乙酸的克数，记为A ，DS=162A/（76-80A）
3.1.2羧甲基化余甘多糖的红外光谱分析
红外光谱分析：分别取1mg EPS和CM-EPS，KBr压片，在4000-400cm-1范围内进行红外光谱扫描。
3.2对DPPH自由基的清除作用
参照Deng[20]等的方法略有改动，准确称取4mg DPPH溶于65%的甲醇，待测样品设定浓度梯度为：2、4、6、8、10、12、16、20mg/mL，二者1:1摇匀暗处反应30min，测定517nm处的吸光值，以50μg/mL VC为阳性对照，3次重复，计算公式如下：
DPPH清除率（%）=[A0-(A1—A2)]/A0×100
式中，A0是不含样品的DPPH溶液的吸光值，A1是含样品的DPPH溶液的吸光值，A2是含样品不含DPPH的水溶液的吸光值。