前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一[1, 2]。随着人们生活习惯、环境的逐渐变化，我国老年人数量的激增，前列腺癌在我国的发病率呈逐年上升趋势。得益于早期的手术切除及辅助治疗，局限性前列腺癌患者具有相对较长生存时间；一旦发展为晚期或转移性疾病，其生存期将急剧减少。
干扰素（IFNs）是一类具有广泛生物学活性的分子，具有调节免疫、抗病毒等作用。近年来，肿瘤学的相关研究中，干扰素的抗肿瘤作用逐步获得认可。临床上，外源性的I型干扰素已用于部分肿瘤的治疗，包括毛细胞白血病、黑色素瘤、肾细胞癌以及卡波西肉瘤等[3]。 在前列腺癌中，干扰素相关的研究较为有限。基于动物水平的研究，Lee等[4]通过将编码人IFN-β的腺病毒液原位注射入裸鼠前列腺癌中，证实IFN-β能够明显抑制肿瘤生长并延长小鼠存活时间；以免疫角度出发，研究者通过免疫组织化学方法对大量临床样本研究，发现人前列腺癌组织中IFN-β的表达被抑制，分析证实IFN-β低表达与前列腺癌生物学复发相关（p=0.035）[5]。遗憾的是，基于体外水平的研究，IFN-β对前列腺癌侵袭能力的影响仍不清晰。本实验拟采用划痕愈合、Transwell侵袭实验初步探讨IFN-β对PC-3细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法
1.1材料
人前列腺癌细胞株PC-3(南方医科大学南方医院实验室惠赠)；RNA干扰序列(上海吉玛公司化学合成)；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、RNA提取试剂盒TrizolReagen(美国Invitrogen公司)；质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化回收试剂盒(北京天根公司)；RPMI1640，Opti-MEM，胰酶(美国GIBCO公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人前列腺癌细胞PC-3在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，37℃、5% CO2湿度下培养，每周传代2 ～3次。
1.2.2 IFN-β siRNA的设计合成 根据NCBI数据库中IFN-β基因已知序列和siRNA设计原则，针对IFN-β靶点设计了1对siRNA，其序列为: IFN-β/147正义5′-GCUCUUUCCAUGAGCUACATT-3′，经Blast检索确认与IFN-β以外的人类已知基因序列无同源性。将其中一对序列打乱排列，通过Blast分析无同源性超过70%的序列，作为阴性对照干扰序列, 序列为: IFN-β/NC正义5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。由上海吉玛公司采用化学合成方法合成上述siRNA。
1.2.3 细胞转染 根据LipofectamineTM2000说明书，取对数生长期PC-3细胞，用LipofectamineTM 2000将质粒导入PC-3细胞。取48μL Opti-MEM稀释LipofectamineTM2000 2μL，室温静置5 min，质粒各2μL用Opti-MEM稀释至终体积为50μL, 室温静置5min，混合上述两种液体，室温静置20 min，将其加入24孔板中。转染48 h后，更换培养液继续培养24 h，换含G418 500mg/L的培养液筛选细胞。12 h后倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率。
1.2.4　划痕愈合实验　取对数生长期细胞铺于6孔板中，每孔6×105细胞/2ml，过夜；用100μl枪头垂直、直线划开细胞，分别于0h、12h、24h、48h时，倒置显微镜下测量划痕宽度。划痕愈合率=（0h划痕宽度-xh划痕宽度）/0h划痕宽度。
1.2.5 Transwell侵袭实验　取对数生长期细胞，用RPMI1640培养过夜，分为PC-3 IFN-β/147、PC-3 IFN-β/NC组，每组设3个孔。Matrigel胶4℃过夜融化，每个transwell上室中铺入Matrigel胶50μl，37℃ 30min凝固。用0.25%胰酶消化细胞，1×PBS洗涤细胞，800r/min离心5min沉淀细胞，将细胞重悬于含氯化钙1mmol/L、氯化镁1mmol/L、氯化锰0.2mmol/L及5g/LBSA的RPMI1640中，调整细胞浓度为1×106/mL，上室每室加200μl细胞悬液，下室加500μl含10%新生牛血清的RPMI1640培养液。37℃ 5% CO2培养48h，取出上室，用棉签擦去膜上室面的细胞，4%多聚甲醛固定膜下室面的细胞20 min，1×PBS清洗3次，每次5 min，结晶紫染色20 min，1×PBS洗净，干燥。于×200高倍镜下，每张膜随机计数5 个视野细胞量。
1.3　统计学方法　采用SPSS 20.0统计软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。

2 结果
2.1 IFN-β siRNA的稳定转染
于荧光显微镜下观察转染细胞，所有细胞均显示荧光，提示成功转染。
2.2 IFN-β siRNA对细胞迁移、侵袭能力的影响
细胞划痕愈合实验中，PC-3 IFN-β/147组的划痕愈合率高于对照组（p<0.001），见图1。Transwell侵袭实验中，PC-3 IFN-β/147、PC-3 IFN-β/NC组穿过Matrigel胶、聚碳酸酯膜的细胞数分别为(48.75士5.19)、(29士3.16)个，PC-3 IFN-β/147组较对照组明显增多（p=0.001）。提示抑制IFN-β表达能够促进PC-3细胞的侵袭能力，增强其恶性表型。

3 讨论
干扰素-β（IFN-β）是一类强大的免疫调控分子，已有的研究提示IFN-β可能部分通过对T淋巴细胞、NK细胞等免疫调控，实现肿瘤的杀伤效应[6-9]，因而IFN-β对肿瘤细胞的直接作用容易被忽视。本研究采用siRNA干扰技术研究IFN-β对PC-3细胞迁移、侵袭能力的影响，以期对IFN-β基因的功能有进一步了解。首先，利用siRNA干扰技术，我们成功构建了siRNA表达载体，IFN-βsiRNA；其次，划痕愈合实验表明下调IFN-β可显著增强PC-3细胞的迁移能力（p<0.001），Transwell侵袭实验表明抑制IFN-β表达可明显增强PC-3细胞的侵袭能力（p=0.001）。结果揭示了IFN-β对人前列腺癌PC-3细胞的恶性表型具有调节作用，IFN-β表达抑制可能是前列腺癌进展的原因之一。