孔雀石绿（C23H25CIN2）（malachite green，MG），又名孔雀绿、碱基绿，为翠绿色有光泽的结晶，属三苯甲烷类染料，常用于工业染料和杀虫剂。MG极易溶于水，水溶液成蓝绿色，它作为驱虫剂、杀虫剂、防腐剂在水产业中使用，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[[[] Pierrard M A, Kestemcnt P, Delaive E, et al. Malachite Green Toxicity Assessed on Asian Catfish Primary Culture of Peripheral Blood Mononuclear Cells by a Proteomic Analysis [J] . Aquat Toxicol, 2012, 114∕115:142-152.],[[] Tsai W T, Chen H R. Removal of Malachite Green from Aqueous Solution Using Low-cost Chlorella-based Biomass [J]. J Hazard Mater, 2010, 175(1∕3) :844-849.]]。
MG
孔雀石绿具有高毒、高残留和高致癌、诱变等危害，美国、日本、英国等许多国家已禁止用于水产养殖业[[[] GAO Jianfeng(高建锋), GU Wenxiu(顾文秀). Malachite Green and Food Safety [J]. Gangdong Chem Ind, 2011, (38) :82-83 . ],[[] Fernanders C, Lalithal V S, Rao K V K. Enhancing Affect of Malachite Green on the Development of Lesions Induced by N-Nitrosodiethylamine in Rats [J]. Carcinogenesis, 1991, 12(5) :839-845.],[[] PENG Jingshu(彭景书), HUANG Minhong(黄敏红), SHE Zhongming(佘忠明), et al. Accumulation and Elimination of Malachite Green in Muscle of Epinephelus Awsoara [J]. J Guangdong Ocean Univ, 2011, 31(1) :84-87.]]。美国于1993年将孔雀石绿列为优先研究的致癌性化学物质，我国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。目前国内外对孔雀石绿的检测多采用高效液相色谱[[[] 郭德华, 叶长淋, 李波, 等. 高效液相色谱-质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物[J]. 分析测试学报, 2004, 23(增刊): 206-208.]]、高效液相色谱-质谱联用[[[] Berwerff A Ldert A, Scherpenisse Peter. Determination of Residues of Malachite Green in Aqutic animals[J]. J Chromatogr B, Analytical Technoloyies in the Biomedcal and Life Sciences, 2003, 788(2): 351-359.]]等方法，但这些方法需要对样品进行排除干扰和分离富集等复杂的前处理工作[[[] GB/T 19587-2005. Determination of Malachite Green and Crystal Violet Residues in Aquatic Product [S]. Beijing: Chinese Standard Publishing House, 2005(in chinese).
GB/T 19857- 2005.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2005.]]，传统的富集方法大都是非特异性的，往往会同时富集干扰成分。而分子印迹聚合物（MIP）具有很强的选择性和亲和性，所以研究并开发MIP对检测孔雀石绿符合发展要求。
基于此，本文以沉淀法制备MIP，并在确定其吸附性等性质能够满足于检测孔雀石绿残留后，研发了以化学发光法为检测手段的MG-MIP-96孔检测板，并测定了检测板的一系列参数使之可用于实际检测。
2 实验材料及方法
2.1材料
恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）、新型电热恒温鼓风干燥箱（宁波江南仪器厂）、Q3200B-型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）、UV752型紫外可见分光光度计（上海佑科仪器表有限公司）、APTP456A型电子天平（深圳市安普特电子科技有限公司）、化学发光仪（德国BERTHOLD科技公司）。
聚乙烯醇（PVA）、孔雀石绿（MG）、副品红（PA）、结晶紫（CV）、甲醇（分析纯）、乙酸（分析纯）、乙腈（分析纯）、甲苯（分析纯）均购自上海生工生物公司。
2.2 分子印迹聚合物的制备
将0.5mmol的MG充分溶解在乙腈甲苯（V:V=3:1）溶液中，加入2mmol的功能单体MAA，于室温下振荡混匀，然后加入10mmol交联剂EGDMA和30mg引发剂AIBN，超声脱气。随后通氮气排除空气后封闭严实。最后于恒温水浴锅中聚合反应。然后干燥、轻微研磨、洗脱，直到洗脱液在分光光度计检测不到孔雀石绿为止，干燥后得到印记聚合物（MIP）。
非印迹聚合物（NIP）的制备除不加模板分子外，其余步骤同上述印迹聚合物（MIP）的方法一样[[[] 徐斐, 张小刚, 等. 沉淀聚合法制备孔雀石绿分子印迹聚合物微球[J]. 东北农业大学学报, 2012, 43(5).]]。
2.3 洗脱方法的研究
选取索氏提取、震荡、磁力搅拌三种不同方法及乙腈、乙醇、甲醇和10﹪的乙酸甲醇溶液三种不同的洗脱液进行洗脱效果的比较。
2.3 MIP吸附性等性质的研究
分别取50mg的MIP、NIP，分别置于10ml含有MG（10ug/ml）的乙腈甲苯（V:V=3:1）溶剂的离心管中，振荡混匀，静置后离心，取上清液，然后分光光度计检测。
吸附量公式[[[] 郭永学, 礼彤, 王立红, 等. 胆固醇分子印迹聚合物微球的制备及其吸附性能[J]. 过程工程学报, 2011, 11(2).]]：Q=(C0-Ct)*V/M。Q为吸附量ug/g，C0为初始浓度ug/ml，Ct为吸附后的平衡浓度ug/ml，V为溶液体积ml，M为MIP或NIP的质量g。
聚合物对模板的特异性吸附能力有公式ɑ=QMIP/QNIP计算。式中ɑ为印迹因子，QMIP为单位质量印迹聚合物的饱和吸附量（ug/g），QNIP为单位质量非印迹聚合物的饱和吸附量（ug/g）[[[] He J, Liu L, Yang G, et al. Preparation, characterization and properties studies of quinine-imprinted polymers in the aqueous phase[J]. Frontiers of Chemistry in China, 2006,1(2): 211-216.]]。
2.4 MG-MIP-96孔检测板的制备及性能检测
将30mg MIPs置于3ml的PVA甲醇水溶液中，超声使其充分悬浮于溶液中。然后每孔50ul加入96孔板，轻微震荡后水浴进行包被。在包被好的96孔板中加入标准品或样品，然后加入50ul酶标抗原轻微震荡后孵育30min，之后甩干孔内液体，用PBST洗板2-3次，甩干。再每孔加入150ul发光液，完成化学发光检测[[[] 常平平, 章竹君. 一种新型分子印迹聚合物基的化学发光阵列传感器[J]. 化学学报, 2009, 67(23):2727-2731.]]。
将5g样品用粉碎机粉碎后匀浆，称取于50mL离心管中，加入10mL乙腈，漩涡震荡5min混匀，随后超声波振荡提取2min，最后4000 r/min离心5min，取上清液用与实验分析。
测定海参、蚬子、牡蛎三种空白样品，重复次数为两列16个平行，计算平均值以及标准差，得到三种样品的检测限。检测限等于3倍的标准差[[[]Themethdedeteetion1imitporeedureoftheU.S.Environmental,ProteetionAgeney.(http://water.usgs,gov/owq/0FR99-193/deteetion.html).]]。
按照上述样品方法处理海参、扇贝和蚬子，分别取上清液1ml用乙腈稀释10倍，每种浓度取四个管，一个管空白，另三管分别加入3个浓度的200µL标准溶液。加样时每浓度一列八个平行。批间变异系数和回收率以不同的5d中的不同批次数据计算。
应检测试剂盒与待检药物类似物、代谢物或共同存在的药物测定交叉反应率。定义一种药物( A )反应率为100%，分别测定各种其他药物的50%抑制浓度。公式为:某种药物交叉反应率=药物A的 IC50/待测药物IC50*100%。
3 结果
3.1印记分子聚合物的制备
制备的分子印迹聚合物MIP、NIP经洗脱后，电镜下观察，结果见图：

图1 MIP(A)、NIP（B）的扫描电镜
Fig.1 SEM photograph of MIP(A) and NIP(B)
由A、B可见，在相同条件下制备的非印记聚合物和聚合物相比，形态明显差异，主要粒径在0.3-1um之间，离子间存在一定的粘连。但有孔径可以看出A、B之间的区别，MIPs的孔径大小形状相似，而NIPs的非常无规则。说明MIPs的聚合是有一定空间倾向或半定向的，是由于模板分子的存在而形成的，分子的结构决定了分子的功能，由此可得MIP可作为人工抗体以替代生物抗体进行药物检测。
3.2聚合物洗脱的研究
采用三种洗脱方法比较，结果如下：

图2 分光光度计检测三种洗脱方法洗脱效果的研究
Fig.2 Research of the elution efficiency of three elution methods by spectrophotometer
模板分子的抽提直接影响到MIP的识别性能及应用，模板分子洗脱不完全会使MIP的分离能力下降，定量分析时也会因模板分子的渗漏而导致结果的不准确[[[] Ellwanger A, Berggern C, Bayoudh S, et al. Evaluation of methods aimed at complete removal of template from molecularly imprinted polymers[J]. Analyst, 2001, 126: 784-92. ],[[] 冯建涌, 朱全红, 等. 长春碱分子印迹聚合物中模板分子的抽提[J]. 南方医科大学学报, 2007, 27(3): 268. ]]。
洗脱结果中，由于0-8h时大部分的模板分子被洗掉，洗脱液中孔雀石绿浓度很高分光光度计无法检测。吸光度值越小代表洗脱液中的模板分子越少，即0-8h洗脱掉的越多，而8h时后洗脱液中的孔雀石绿越来越少。由图知，选择索氏提取器进行洗脱。
然后分别以乙腈、乙醇、甲醇和10﹪的乙酸甲醇溶液为洗脱液在索氏提取器中进行洗脱，选择最适洗脱液。结果如下：

图3分光光度计检测三种洗脱液洗脱效果的研究
Fig.3 Research of the elution efficiency of three eluents by spectrophotometer
甲醇的H键形成能力强，极性大且溶剂的浸透性好，用作洗脱剂时效率更高。在甲醇中加入一定量的乙酸可以增加溶剂的洗脱作用力，破坏模板与聚合物之间的结合力，有效减少模板分子的渗漏。所以选择10﹪的乙酸甲醇溶液为洗脱液。