冬虫夏草是中华虫草菌寄生于虫草蝙蝠蛾幼虫体后发育成的真菌子座（谓之“草”）和充满菌丝的僵死幼虫（谓之“虫”）的复合物，在分类学上，冬虫夏草隶属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属[1]。冬虫夏草化学成分复杂，含有虫草素、核苷类、氨基酸、多肽、多糖类、糖醇、甾醇类、脂肪酸、酯、烷烃、多胺类物质等活性成分[2]。具有抗肿瘤[3]、抗氧化衰老[4]、抗心肌缺血及心率失常[5]、调节内分泌[6]、调节免疫力[7]、调节脂类代谢[8]、镇静中枢[9]等多种药理功能。
近来由于生态环境的退化和人为的过度采挖，虫草的产量大幅下降，而且个体变小，质量也有所下降，冬虫夏草自然资源日已枯竭，而且价格昂贵，已不能满足人们对虫草日益增长的需求[10]。通过人工培养获得冬虫夏草，给这一名贵药材继续长久为人类服务提供了一条新思路。近来国内外众多研究机构在冬虫夏草人工培育、人工菌丝体生产、成分、药理等方面做了大量工作，研究表明，人工虫草菌丝体与天然冬虫夏草具有相似的化学成分[11]、药理作用和临床疗效[12]，且毒性比天然少，这就为人工培养虫草菌丝体代替天然冬虫夏草提供了科学依据。
迄今为止，深层发酵研究已取得较大进展，通过液态深层培养可以实现菌丝体的快速生产，同时通过优化培养条件，以提高其生物活性物质的含量，便于提取目的组分[13]。此外，还可通过连续性地大规模工业化生产，消除某些难以控制的环境因子，缩短生产周期，降低生产成本，为深加工提供广泛的应用领域[14]。因此，深层发酵培养冬虫夏草具有重要的理论和实践意义。本实验对冬虫夏草液态发酵生产胞内多糖、腺苷和菌丝体的发酵条件进行研究，以期为冬虫夏草的工业化生产提供必要的理论基础。


1材料与方法
1.1 材料与试剂
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)购于广东省微生物菌种保藏中心；标准品腺苷购于Sigma公司；实验所用其他试剂如无特殊说明均为分析纯。
1.2 仪器与设备
恒温培养振荡器（ZHWY-211B） 上海智诚分析仪器制造有限公司；精密鼓风烘箱（ES-15） 施都凯仪器设备（上海）有限公司；超声波破碎仪（VB800） 美国Sonics公司；745紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪，二极管阵列检测器 日本岛津公司。
1.3 培养基
斜面培养基(%)：含马铃薯汁20、葡萄糖2.0、琼脂2.0、KH 2PO 4 0.3、 MgSO 4·7H2O 0.15、pH值自然；
种子培养基(%)：含马铃薯汁20、葡萄糖2.0、KH 2PO 4 0.3、 MgSO 4·7H2O 0.15、pH值自然；
发酵培养基(%)：含葡萄糖2.0、蛋白胨1.0、KH 2PO 4 0.3、 MgSO 4·7H2O 0.15、VB1 0.08、pH值自然。
1.4 培养方法
斜面培养：将保藏的冬虫夏草菌种接种于PDA斜面，25℃恒温培养5 d，于4℃冰箱中保存备用。
种子液培养：将活化的斜面菌种接入种子培养基中，于转速 140 r/min、温度24 ℃的摇床中培养3 d。
发酵培养：在500 mL的锥形瓶中加入发酵培养基，装液量分别为50、100、150、200和250 mL，分别按2%、3%、4%、5%和6%(V/V) 接种量接入液体种子，选取20、22、2 4、2 6 和28 ℃五个温度，发酵时间为2、3、4、5和6 d，摇床转速分别为100、120、140、160和180 r/min进行发酵培养。
1.5 检测方法
1.5.1 菌丝体干重的测定
将发酵液以3000r/min离心分离15min，弃去上清液，用蒸馏水反复冲洗，重复离心后，于60 ℃烘干至恒重，称取菌丝体干重。
1.5.2 胞内多糖含量测定
1.5.2.1溶液的配制
葡萄糖标准溶液：精密称取于105℃干燥至恒重的葡萄糖0.0500 g，置于250 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每l mL含0.2 mg的标准溶液。
6%苯酚溶液：精密称取6 g重蒸苯酚，置于100 mL棕色容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放入4℃冰箱中冷藏保存，备用。
1.5.2.2葡萄糖标准曲线的制作
精密吸取葡萄糖标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6，2.0mL于15 mL具塞试管中，分别加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸4.5 mL，振荡摇匀，室温放置10分钟。另取2.0 mL蒸馏水按上述方法操作，作为空白对照。在490 nm波长处测定吸光度。以葡萄糖含量（X，μg/mL）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
1.5.2.3胞内多糖的测定[15]
精确称取0.500 g干燥菌丝体于试管中，加入15 mL蒸馏水，超声破碎10 min之后，置于90 ℃恒温水浴锅中浸提2 h，离心得上清液即为样品溶液。吸取样品溶液0.1 mL，置于15 mL具塞刻度试管中，加水至2.0 mL，并加入6%苯酚溶液0.5 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸4.5 mL，振荡摇匀，室温放置10分钟。另取蒸馏水0.1 mL同上操作制得空白溶液。于490 nm处测定吸光度值，并计算出胞内多糖含量。
1.5.3 腺苷含量测定
1.5.3.1溶液的配制
提取液：无水甲醇与高纯水按体积比1:1配制成提取液，保存备用。
腺苷标准溶液：精密称取腺苷标准品20 mg，置100 mL容量瓶中，加提取液溶解，摇匀，定容至刻度，得质量浓度为0.2 mg/mL的标准溶液。
1.5.3.2色谱条件[16]
色谱柱 Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温30 ℃；流动相：水:甲醇（85:15），流速1.0 mL/min；进样量20 μL；检测器波长为260 nm。
1.5.3.3腺苷标准曲线的制作
精密吸取腺苷标准溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL于15 mL具塞试管中，分别加提取液至10.0 mL，摇匀。分别以进样量20 μL进样，记录峰面积。以腺苷含量（X，μg/mL）为横坐标，为峰面积（Y）纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。
1.5.3.4腺苷的测定
精密称取冬虫夏草菌丝体0.250 g，置具塞锥形瓶中，加入提取液10 mL，超声提取，离心，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后即得样品溶液。按照1.5.3.2项下的色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算出腺苷含量。
2 结果与分析
2.1 装液量对菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量的影响
表1 装液量对各项指标的影响
Table1 Effect of different liquid volume on yields of the three indicators
装液量（mL） 菌丝体干重（g/L) 胞内多糖含量(mg/g) 腺苷含量(μg/g)
50 13.794±0.115 49.34 578.2

100 14.542±0.047 67.51 620.2

150 13.905±0.114 60.27 601.5

200 12.353±0.073 47.28 556.8

250 11.491±0.187 38.46 480.3


发酵液为菌丝体的生长提供了营养物质，而装液量多少不仅反映了营养物质的多少，也会直接影响发酵过程中的通气量。由表1可见，在装液量为50～100mL时，随着装液量的增加，菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量均呈上升趋势；当装液量为100mL时，菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量均为最高；在装液量超过100mL时，菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量均呈下降趋势。所以，应选择100mL的装液量。因培养基量少，易导致培养过程中营养缺乏，而培养基装液量太多，则培养过程中通气效果不理想，这样都会影响菌种生长繁殖。
2.2 接种量对菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量的影响

表2 接种量对各项指标的影响
Table2 Effect of different liquid volume on yields of the three indicators
接种量（%） 菌丝体干重（g/L) 胞内多糖含量(mg/g) 腺苷含量(μg/g)
2 15.952±0.198 52.36 523.4

3 16.431±0.221 68.02 621.2

4 15.924±0.181 68.11 597.9

5 15.789±0.074 60.34 596.4

6 15.304±0.045 61.22 568.3


接种为发酵过程中提供了生长旺盛、 生命力强的种子，接种量的大小对于发酵周期、 产量具有明显的影响，为确定最佳的接种量，试验以2%～6% 的接种量接种于100ml发酵培养液中，于24 ℃条件下培养4 d。从表2可以得出，随着接种量的增加，所得菌丝体干重及胞内多糖和腺苷含量均呈上升趋势，并在3%处达到最大值；当接种量大于3%时，所得菌丝体干重呈平缓下降，胞内多糖及腺苷含量也相应减少，与菌丝体产量呈现出一定的正相关性。