摘要：目的 了解云南省师宗县采集的骚扰阿蚊分子鉴定及COI基因序列特征。方法：2015年7月在云南省师宗县采集蚊虫标本，通过形态学鉴定手工分检出疑似骚扰阿蚊，再提取蚊虫基因组DNA，用COI基因特异引物和序列测定，然后采用生物信息学软件进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。结果 在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只，其中阿蚊45只（14.33%），挑选了10只疑似骚扰阿蚊进行序列分析，结果显示10只蚊虫COI核苷酸序列同源性在97.1%-100%之间，遗传进化分析显示10只蚊虫样本全部与骚扰阿蚊位于同一进化分支内。结论 采用分子鉴定的方法可快速、准确地进行蚊虫种类鉴定。
骚扰阿蚊（Armigeres Subalbatus）骚扰阿蚊（Armigeres Subalbatus）嗜牛血及人血，多在室内、畜舍内、厕所内栖息，黄昏及黎明时吸血活动较多，在厕所内白天亦可吸血。此蚊幼虫孳生于稀粪坑内，密度很高，以幼虫越冬，骚扰阿蚊在我国分布广泛，是流行性乙型脑炎和登革热的可能传播媒介，对人类健康的危害极大[1]。为了能更好地防治蚊媒传染病，准确鉴定媒介蚊种是非常必要的。目前，形态学鉴定是最常用的方法，但因媒介蚊类鉴定特征复杂，极易混淆出错，且在近似种的鉴定上对科研人员专业和经验的积累提出了更高的要求。因此急需一种快速、精确、通用的分类鉴定工具。线粒体细胞色素C氧化酶I亚基（mtDNA COI）基因是目前基因库中数据最多的片段，结构与进化动力学研究比较清楚的基因之一，其结构相对保守，种间变异较大，能够提供丰富的系统发育信息。基于线粒体COI基因的DNA基因序列分析技术可以快速完成物种的鉴定。因此，本文对采集的骚扰阿蚊进行分子鉴定以及COI基因序列分析，从分子水平了解采集的蚊虫标本与骚扰阿蚊的遗传进化关系，为研究我国蚊虫分子分类提供资料，这对预防和控制以骚扰阿蚊为传播媒介的疾病如流行性乙型脑炎和登革热的发生和传播具有一定的科学意义。
1 材料与方法
1.1 标本采集
2015年7月在云南省师宗县县城周围农户家牛圈采用诱蚊灯（功夫小帅，12 V; 300 mA; 湖北武汉）进行标本采集，采集时间段约为晚间18:00至次日早晨8:00共14h。次日早晨收集标本，将标本置于-20℃冰箱中冷冻20～30min，待存活的蚊虫刚好冷冻死亡后，取出标本根据蚊虫形态学特征采用解剖镜进行蚊虫形态学鉴定，将形态学鉴定为阿蚊属的蚊虫标本放入70%乙醇中保存。
1.2 蚊虫DNA提取及PCR扩增
从乙醇中取出阿蚊标本，在解剖显微镜下分离头胸部及腹部，腹部用DNA提取试剂盒（天根公司）按说明书提取蚊虫DNA，操作步骤如下：每只按蚊标本用缓冲液GA 200µl，充分研磨，加20 µl Proteinase K，56℃温浴过夜，加200 µl缓冲液GB混匀，70℃放置10分钟。加200 µl无水乙醇充分混匀15分钟，过柱，分别用500 µl缓冲液GD和600 µl漂洗液PW洗涤，加60 µl洗脱缓冲液TE洗脱DNA。取2 µl cDNA做反应模板，用COI特异引物[2]进行PCR扩增，依次加入10XBuffer 5µl、2.5mmol /ldNTP 5µl、上下游引物各1.25µl、rTaq酶0.75µl、去离子水31.75µl，充分混匀，94℃预变性5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃60sec，35个循环，72℃延伸10min，1%琼脂糖电泳检查扩增条带，用TaKaRa DNA fragment Purification Kit纯化PCR扩增产物，PCR扩增产物由昆明硕科公司进行测序。
作者：胡骑，王静林*，何于雯，李楠