三七总皂苷（panax notoginseng saponis， PNS）是从五加科人参属多年生草本植物三七中提取的主要有效成分，有活血祛瘀，活络通脉等功效。 近30年来，国内外科学家对三七的药理作用进行了广泛研究，发表了大量的研究报告，揭示了三七在血液系统、心血管系统、神经系统、免疫系统、代谢系统，以及抗炎、抗衰老等方面的生理活性，国内有研究指出[1]，中药三七有诱导癌细胞凋亡的作用，但在抗肿瘤方面的实验研究还没有得到广泛的开展，其诱导肿瘤细胞凋亡的途径和靶点仍缺乏深入研究。本实验以体外培养的细胞株BEL-7404人肝癌细胞为研究对象，探讨不同浓度的三七总皂苷作用于人肝癌细胞株后，通过对线粒体膜电位及caspase-9、caspase- 3相关活化因子的影响探索其诱导细胞凋亡作用机制。
1 实验材料与方法
1.1 药物及材料
1.1.1人肝癌细胞株BEL-7404细胞由上海细胞库提供 ；1640培养基购自 Gibco 公司；胎牛血清购自Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO）购自 Sigma 公司；线粒体膜电位检测试剂盒、凋亡试剂盒购自BD公司；caspase-3、caspase-9 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。
1.1.2 仪器设备：流式细胞仪（美国贝克曼，CytoFlex）、低温高速离心机（德国eppendorf）、生物安全柜（博讯）、CO2培养箱（赛默飞）、酶标仪（赛默飞）
1.2实验方法
1.2.1细胞培养及处理
人肝癌细胞BEL-7404贴壁生长于PRMI-1640培养液中，其内包含有 100u/ml链霉素，100u/ml青霉素，浓度为10%胎牛血清。3-4天传代换液一次。冻存：取对数生长期细胞，0.25%的胰酶消化制成细胞悬液，移至离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入1ml冻存液，用吸管吹打均匀制成细胞悬液，细胞浓度为106-107/ml。转入到冻存管，置液氮中保存。复苏：液氮中取出的冻存管，1分钟内使其溶化，将细胞悬液移入无菌离心管中， 1000rpm离心5min，弃上清，沉淀加5ml培养液，吹打、离心、弃上清。加用 10ml 全培养基重悬，轻微吹打均匀，将细胞悬液移入培养瓶中，置于5%CO2培养箱培养。
1.2.2实验分组
① 细胞对照组：包含有细胞的培养基、无药物；
② 细胞阳模组：包含有细胞的培养基、加阿霉素（10μg/ml）；
③设定药物浓度
选择三七总皂苷标准品（由广西中医药大学第一附属医院医学分子生物学实验室统一购买），参阅相关文献及预实验结果，选择三七总皂苷的终浓度为 20、40、60、80、100μg/ml。
1.2.3细胞生长抑制率测定
取对数生长期细胞BEL-7404，待细胞贴壁率达到 90%以上时，胰酶消化，制成细胞悬液，再将细胞悬液转入离心管中，1000r／min 离心 10min。弃去上清液，加入适量含 10%胎牛血清的1640培养液，计数板计数细胞，将 1.0×104／ml个细胞加入96孔培养板中，每孔200μl，培养24h，待细胞贴壁后，按实验分组加药，每孔终体积为200μl，继续培养24、48、72h后，每孔加入CCK-8试剂10μl反应，继续培养4h，用酶标仪在波长450nm处测OD值，计算细胞生长抑制率。
1.2.4流式细胞仪检测细胞细胞凋亡
取对数生长期的细胞以1×105个/ml密度接种于 6 孔培养板中，贴壁过夜，经药物孵育48h后用0.25%无EDTA的胰酶消化收集所有细胞，每样本细胞数大于 1×105个/ml，用预冷的PBS洗1次后，加 400μl结合缓冲液，轻轻混匀细胞后加2.5μl Annexin-FITC和2.5μl PI，避光孵育20min后立即进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。
1.2.5线粒体膜电位检测
取对数生长期的细胞以1×105个/ml的密度接种于6 孔培养板中，贴壁过夜，经药物孵育48 h后用 0.25%无EDTA的胰酶消化收集所有细胞，每样本细胞数大于 1×105个/ml，用预冷的PBS洗1次：
① 将JC-1染料溶于二甲基亚砜（DMSO）中，制备成浓度为1μg/μl的JC-1工作液。