枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)是微生态制剂的常用菌种之一，因其具有较高的蛋白酶和纤维素酶活性，且有较强生物夺氧能力，耐高温高压，易贮存等特点，应用广泛[1]，特别是在畜禽粪便发酵有机肥的过程中，利用微生物菌剂堆肥发酵，是将畜禽粪便无害化处理的最有效的手段之一，堆肥发酵，其实质是微生物通过代谢繁殖对有机质进行分解，转化为无机态的养分的过程，通过添加外源微生物来增大微生物的数量，不仅可以缩短发酵时间，还可以提高有机肥的肥效[2-3]。而决定发酵效果的一个主要因素是添加的菌剂能否在一定的生态系统中定殖 ，并适应恶劣的环境[4]。目前对微生物定殖能力的检测方法主要包括：外来基因标记（如绿色荧光蛋白）、DNA 和RNA探针法和天然抗生素标记法等[5]。其中，抗生素标记法具有方便快捷、消耗低、更实用等优点，且不会导致菌株其他重要特性的丧失，因此抗生素标记方法被作为一种常用的手段用来检测微生物的定殖能力。本实验中的枯草芽孢杆菌GX7是由发酵鸡粪中分离所得，具有良好的产酶特性，本研究的目的就是利用抗生素标记法检测GX7在鸡粪发酵中的定殖能力，通过鸡粪发酵中一些参数的变化，研究GX7在发酵过程中的作用，为畜禽粪便发酵有机肥提供理论依据。
1．材料与方法
1.1仪器与材料
供试菌株为枯草芽孢杆菌GX7，由实验分离所得。
鸡粪，由辽宁省朝阳市兴和牧业有限公司提供。
牛肉膏蛋白胨培养基(NA)：牛肉膏0.3%；蛋白胨1%；NaCl 0.5%； pH7.0-7.2； 121℃高温蒸汽灭菌30min。
CMC-Na培养基：牛肉膏0.5%；蛋白胨1%；NaCl 0.5%；CMC-Na 0.5%； pH7.0-7.2； 121℃高温蒸汽灭菌30min。
液体培养条件： pH7.0、37℃、转速180r/min、装液量50ml/250ml、接菌量2%
市购药品：抗菌药物药敏纸片（利福平(Rif)、卡那霉素(Km)、氨苄青霉素(Ap)、链霉素(Str)、四环素(Tet)、庆大霉素(Gen)、红霉素(Ery)、氯霉素(Cho)、环丙沙星(Cip)、新霉素(Neo)） 杭州微生物试剂有限公司
1.216S rRNA基因序列
引物设计参照Genbank登录的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列，用Primer premier5.0软件分析后，设计一对引物[6]，正向引物：5'-GGAC GGCTGAGTAACACG-3'反向引物：5'-GACAACGCTT GCCACCTA-3'，16SrDNA测序由宝生物工程（大连）有限公司完成。
1.3抗生素敏感性试验
将供试菌株均匀涂于NA培养基平板，分别放置10种抗生素药敏纸片，置于恒温培养箱中，37℃培养24h后测量抑菌圈直径。
1.4耐药突变菌株的获得
根据试验结果选用Rif作为标记GX7用抗生素。分别配制Rif浓度为0、6.25、12.5、25、50μg/ml的NA培养液，取纯化好的GX7单菌落接种到含Rif浓度为6.25μg/ml的NA液体培养基中，按液体培养条件培养[7]，待出现混浊后，用稀释平板法将稀释后的菌液涂匀在含相同浓度Rif的平板上，37℃培养，待长出单菌落后，挑菌转入下一高浓度Rif的NA培养液中培养，至出现菌体，依次类推[8]。
1.5耐药突变菌株BX7稳定性试验
1.5.1耐药稳定性试验
将获得的耐药突变菌株BX7在不含Rif的NA培养基上连续传代培养15次后，再接种至含Rif200μg/ml的NA培养基，观察生长情况；将BX7菌株置于低温（2-4℃） 保存3个月后，活化，再接种至含Rif200μg/ml的NA培养液中，24h后涂NA平板，观察是否有菌落生长[9]。
1.5.1遗传稳定性试验
BX7与出发菌株GX7的DNA同源性比较，用含Rif的NA培养基从发酵鸡粪中回收突变菌株，经多次纯化，提取其DNA，用16SrRNA基因的引物对其扩增，并与原始菌株GX7比较。
1.6耐药突变菌株BX7生长曲线及酶活力测定
1.6.1耐药突变菌株BX7生长曲线测定：
取14个50ml NA /250ml三角瓶，加入1mlBX7菌种过夜培养液（37℃180r/min培养24h），按液体培养条件培养。0至24h每2小时取一次样，标注时间；24h以后每4小时取一次样，标注时间，32h结束。每个时间点做3个平行处理[7]。用未接菌培养基作为空白，600nm波长下测OD值，取平均值，绘制生长曲线。
1.6.2突变菌株BX7酶活力分析方法
将1mlBX7菌种分别接于50ml /250mlCMC-Na液体培养基和NA液体培养基中，按液体培养条件培养后转入已灭菌的EP管中，40℃，4200rpm，离心10min，上清液即为粗酶液。纤维素酶活力定量分析，采用DNS显色法[10]。蛋白酶活力定量分析，采用福林酚法[11]。计算各菌株粗酶液的酶活力，绘制纤维素酶活力曲线和蛋白酶活力曲线。
1.7突变菌株BX7在鸡粪中定殖
将BX7按0.3%的比例混合至鸡粪中，发酵过程中的第1、4、7、10、13、16天取样，用含Rif200μg/ml的NA培养基计活菌数，每个样品测3次，取平均值。