在现有文献中多数研究都以预防与年龄有关的慢性疾病为出发点,鲜有以借鉴长寿地区饮食结构的角度来切入并构建健康长寿饮食模式再进行研究验证的报道;而且因各地的食材和气候差别很大,国外的饮食模式无法被中国普通人群所接受,从而有必要探索适合中国普通居民健康长寿的新型饮食模式。搜索并未发现有从饮食模式对衰老小鼠的运动能力和抗焦虑水平影响效果的报道,且未发现有从改善衰老动物运动协调能力及抗焦虑能力来对饮食模式的效果开展研究的报道。为此,本研究试图凝练巴马长寿老人的饮食特点及特色益生菌构建巴马特色饮食模式,再利用动物模型进行验证,进一步从致衰小鼠运动能力和抗焦虑方面来探索巴马特色饮食模式对衰老小鼠的抗衰老效果,以期为适合中国普通居民健康长寿的新型饮食模式的构建提供理论基础。
1材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
6周龄SPF级昆明小鼠,雌雄各半,重量25±2g,购自广西医科大学试验动物中心(试验动物生产许可证号:SCXK桂2014-002),饲养温度控制在24±2℃,相对湿度60±10%,12h昼夜交替,每天给予5g饲料[13],自由饮水。
D-半乳糖,上海源叶生物技术有限公司;基础饲料,购自北京科奥协力饲料有限公司,符合GB13078 和GB14924.3-2010;低聚果糖,量子高科(中国)生物股份有限公司;低聚木糖,上海源叶生物技术有限公司;异麦芽低聚糖,山东天久生物技术有限公司;大豆异黄酮,上海源叶生物技术有限公司;维生素A醋酸酯干粉,新昌新和成维生素有限公司;维生素E粉,新昌新和成维生素有限公司;抗坏血酸钠,上海源叶生物技术有限公司;白藜芦醇,上海源叶生物技术有限公司;LT-614干酪乳杆菌(分离自广西巴马百岁老人)由本试验室提供;P132发酵乳杆菌(分离自广西巴马百岁老人)由本试验室提供。
培养基 MRS 按国标方法配制,固态添加1.5%琼脂。
1.2 仪器与设备
超微粉碎机 浙江省温岭市创力药材机械厂;旷场测试系统 西班牙Panlab公司;立式高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械有限公司;超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;KQ320DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;WGL-125B电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 小鼠饲料的制备
将小鼠科奥协力基础饲料打粉,以此为基础设计巴马特色饲料并制成粒。依据本团队宋奇等前期的[11]研究结果,结合GB14924.3-2010 试验动物 配合饲料营养成分、中国居民膳食营养素推荐摄入量十倍、保健食品检验与评价技术规范(2003年版)、巴马百岁组营养素摄入量[9, 14],并参考了侯放亮、李广海等方法[15, 16]和相关文献[14, 17-19],设制了巴马特色饲料的高、中、低剂量组。具体为:巴马特色饮食高剂量组是依据GB14924.3-2010 试验动物 配合饲料营养成分及文献[20-26],巴马特色饮食中剂量组依据中国居民膳食营养素推荐摄入量十倍、保健食品检验与评价技术规范(2003年版)及文献[21-24, 27],巴马特色饮食低剂量组参考巴马百岁老人摄入量来制定,具体配方可参照宋奇等人的研究成果[11]。
1.3.2 动物分组及处理
SPF级昆明小鼠适应性喂养1周后,雌雄各半,每组10只,随机分成6组:年轻对照组、衰老模型组、巴马特色饮食模式高剂量组、中剂量组、低剂量组和益生菌组。除年轻对照组注射等体积生理盐水外,其余5组每日上午颈背部皮下注射100g/L D-半乳糖溶液,0.2mL/20g建立衰老模型。从造模第9周开始,巴马特色饮食模式高、中、低剂量组每天分别以巴马特色饲料喂养,其余组继续以基础饲料饲喂;高、中、低剂量组及益生菌组分别按0.1ml/10g的体积量灌胃浓度分别为109cfu/ml的干酪乳杆菌LT-L614、发酵乳杆菌P132(其中LT-L614∶P132=1:1),其余组灌胃等量生理盐水,持续9周后,开展运动能力和抗焦虑测试,整个饲养过程中无小鼠死亡,同时观察记录小鼠的生存状态和生物学行为的动态变化,且每周称量其体重1次。
1.3.3 行为学试验
旷场试验参照文献[28-31]进行。紧绳试验 参照文献[32, 33]进行。
1.4 数据统计分析
本试验数据采用本试验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析,所有结果表示为±s,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示两组间数值差异显著,P<0.01表示两组间数值差异极显著。