基因诊断与红细胞脆性、MCV、MCH、Hb电泳在

地中海贫血病检测中的价值

[摘要]目的  探讨基因诊断与红细胞脆性、MCV、MCH、Hb电泳在地中海贫血病检测中的价值。方法 在2006年1月至2007年6月《对湛江地中海贫白遗传病的普查及建立防治网络的研究》过程中，以红细胞脆性一管法、MCV、MCH、Hb电泳行平行联合检测为初筛，对一种或多种异常者以基因分析作为地贫确诊试验。结果 ①对860对新婚待育夫妇同时做红细胞脆性，MCV、MCH、Hb电泳平衡检测。红细胞脆性一管法筛选出异常170例，MCV、 MCH法筛选出异常155例，Hb电泳法筛选出异常141例。②基因诊断分析：基因检测确诊为地贫139例。地贫发病率8.1%，α地贫占5.4%，β地贫占2.7% 。③用红细胞脆性一管法筛选异常的170例中真阳性135例，PV+（阳性结果预示值）为79.4%；用平均红细胞体积MCV及平均红细胞血红蛋白含量（MCH）法筛选异常的155例中真阳性138例，PV+为89.09%；用Hb电泳法筛选异常的141例中真阳性136例，PV+为96.5%。结论：以阳性结果的预示观察实验结果的使用价值，在地中海贫血初筛中，Hb电泳法优于MCV、MCH的检测，优于红细胞脆性一管法。P＜0.05。联合筛查、基因诊断对预防和降低重型地中海贫血患儿出生具有重大意义。

[关键词]地中海贫血 基因诊断 红细胞脆性 MCV  MCH  Hb电泳

地中海贫血（简称地贫），是一类由常染色体遗传性缺陷，引起珠蛋白链合成障碍，使一种或几种珠蛋白数量不足或完全缺乏，因而红细胞易被溶解破坏的溶血性贫血。不论是α或β重型地贫都会导致夭折或严重贫血，目前又无根治方法，因而预防重型患儿出生是当前实行优生的一个重要方面[1]。地贫被世界卫生组织列为危害人类健康的6种常见病之一，广东省是地贫的高发区，20世纪80年代广东省卫生厅地贫筛查结果：α地贫为7.3%，β地贫为1.85%-3.36%[2]。大多数地贫基因携带者都不知道自己带有地贫遗传基因，遗传知识缺乏。降低重型地贫患儿出生率的较好方法是通过全面筛查新婚等育夫妇，基因确诊，评估出生患儿风险。优生咨询医生一般根据红细胞脆性，MCV结果进行地贫初步诊断[3]。因此我们在《对湛江地中海贫血遗传病的普查及建立防治网络的研究》过程中，平衡检测对象外周血红细胞脆性，MCV、MCH、Hb电泳，对异常者进行地贫基因检测，以评价红细胞渗透脆性试验，MCV、MCH、Hb电泳在地中海贫血病的初筛中的使用价值。##end##

资料与方法

1、对象

从2006年1月—2007年6月在《对湛江地中海贫血遗传病的普查及建立网络的研究》过程中，通过计生系统现有的婚育学校网络，组织大群体的育龄夫妇，接受检查者有860对夫妇（共1720例）均为新婚夫妇。分别检测红细胞脆性，MCV、MCH、Hb电泳。对初筛中有一项或多项异常者进行基因检测进行确诊。

2、检测方法

2.1 红细胞一管脆性试验，采静脉血2ml，肝素抗凝，使用广州米基科技贸易公司研制提供的试剂盒，721型分光光度计530nm波长比色，溶血度低于63%者为异常。（红细胞脆性减低）

2.2 平均红细胞体积（MCV）及平均红细胞血红蛋白含量（MCH）检测，使用迈瑞BC-2800全自动血细胞分析仪，采外周静脉血，行预稀释—全参数检测，读取MCV、MCH值。MCV小于80fL及MCH小于26pg为异常。

2.3 血红蛋（Hb）电泳  使用Dyy-6c电泳仪，醋酸纤维薄膜电泳法，结果观察参照：美国Helena公司血红蛋白电泳图谱进行分析。

2.4 柱层法（HbA2）检测  使用西班牙Siosystems SA公司提供柱层析试剂盒。β地贫HbA2常在4%以上，而α地贫患者HbA2通常降低。

2.5 抗碱血红蛋白（Hb F）测定  按照《全国临床检验操作规程》（第二版 叶应妩 王毓三主编）Hb-F碱变性试验进行，β-地贫患者明显增高，重型患者可达80%-90%。

2.6 基因分析  α地贫使用四重PCR技术，β地贫使用PCR/反向杂高（RDB）法，由广州海伦娜贸易有限公司提供试剂。由Hb电泳，HbA2检测、HbF检测结果初步分析分别进行基因检测。

3、统计学方法  用SPss11.00软件行x2检验及成组t检验  

结果

以基因诊断为确诊列下表示结果：

红细胞脆性   MCV（MCH）  Hb电泳筛查地贫结果

讨论

   1、人珠蛋白基因分为两大类：类α基因和类β基因，它们均呈簇状排列并位于不同的染色体上 [4]。地贫是一种异质性疾病，任何珠蛋白基因突变只要造成a和非a肽链间的合成失平衡均可导致地贫的发生[5]。突变所造成的后果可以影响珠蛋白基因的转录，转录后加工、翻译，甚至翻译后产物的稳定性[6]。地贫在临床上表现为慢性、溶血性贫血，其临床表现的轻重与受累珠蛋白的肽链合成减少的程度及相对过剩的珠蛋白肽链在红细胞内的稳定性相关[7、8]。珠蛋白肽链间的合成失平衡及相对过剩珠蛋白肽链的存在不仅影响红细胞的成熟，也影响红细胞的存在。除细胞分裂受到干扰，细胞器及细胞膜成份易受氧化性破坏等因素外，由于柔韧性下降，异常红细胞的机械性损害增加[9]。

2、红细胞在低渗盐水中时，红细胞内渗透压较大，水分子向膜内渗透，致使红细胞肿胀、破裂、引起容血。α（或β）地贫患者的红细胞由于β（或α）珠蛋白链合成过多，沉积在红细胞膜上，使其僵硬，变形性降低，对低渗盐水的低抗力增强，导致红细胞渗透脆性降低，这一特点为α、β地贫所共有,所以红细胞渗透脆性试验可以作为地贫初筛。地贫属于小细胞，低色素性贫血，所以平均红细胞体积（MCV）及平均红细胞血红蛋白含量（MCH）也是地贫初筛指标。但是必须排除缺血性贫血等其它小细胞低色素性贫血。其它尚有Hbs、C、E、D等。对MCV、MCH降低，脆性小于63%的可疑地贫者应进一步明确可能属于α或β地贫（其它型罕见）。常规先排除β地贫，因为有相对敏感指标HbA2  HbA2的测定可用电泳或柱层析法。层析法较电泳法定量准确，重复性好、操作方便。但电泳法可同时检测Hb Bart’s、HbH、E等，所以两者各有优缺点，互相补充。通常先作HbA2 柱层析定量，HbA2不升高又可疑地贫者，一方面作电泳筛查，同时做HbF测定。HbF测定主要针对某些重型或中间型β地贫，表现为HbA2正常或稍高，甚至降低，但HbF明显升高，据此基本可筛查出B地贫。明确诊断使用基因技术，α地贫的分子机制是基因缺失，因此可采用跨越断裂点的PCR扩增法，将引物分别设计在断裂点的上游（正向引物）和下游（反向引物），这样可通过PCR产物直接确定被检测的DNA基因型，α地贫由于该突变的缺失范围约20kb基因片段，因此不能扩增正常的等位基因片段（距离太远），而缺失存在时，引物对靠近可扩增出相应的阳性片段。α地贫1杂合子（- -/aa）和HbH病（- -/-a）应有一条630bp和一条224bp的产物带。只有224bp带而无630bp带，可以是正常或α地贫2纯合子（-a/-a）。只有630bp带而无224bp带则为Bart’s水肿胎（- -/- -）。β地贫的发生不是基因缺失引起，而是基因点突变的结果。β地贫的基因突变类型超过300种[4]。（在中国人群中，β地贫基因突变28种[10]）。使用PCR/反向杂交（RDB）法，对基因类型进行分析,基本可以确诊在我国人群的β地贫基因。

3、我国在用于防治遗传病的人力和物力还相当缺乏，在大群体的地贫普查当中，应把红细胞脆性一管法，MCV、MCH、Hb电泳、HbA2、Hb F测定作为常规项目。此几种方法简便、经济、实用。在筛查时应用红细胞脆性一管法，MCV法与Hb电泳平行联合检测是地贫筛查最合理的方法[11]。本研究地贫的筛查和诊断结果说明，在地贫筛查中红细胞脆性一管法、MCV、MCH法、Hb电泳法的灵敏度分别为97.1%、99.3%、97.8%；特异性分别为97.8%、98.9%、99.8% 由此可见几种方法的灵敏度及特异性都有较好的一致性（之间无显著性差异，P＞0.05）。而阳性结果预示值（PV+）指示：红细胞脆性法为79.4%  MCV、MCH法为89.0%。Hb电泳法为96.5%。方法之间有显著性差异，P＜0.05。Hb电泳法阳性结果预示值高，但具体操作需较长时间，程序较复杂,所以地贫大群体筛查首选应该是MCV、MCH法及红细胞脆性法，只要MCV、MCH、红细胞脆性都正常就可以排除地贫。有关报道：在地贫筛查中MCV与MCH的检测优于红细胞性试验[12]，与本研究相同。而在红细胞脆性试验，MCV与MCH法，Hb电泳法都有不同程度的假阳性、假阴性，如果两种或多种方法联合使用可以减少假阳性、假阴性。有关报道也证实联合检测是地贫筛查的最合理的方法[11]。

综上所述，对地贫实施干预必须对大群体（新婚待育夫妇）进行血常规（MCV、MCH）及红细胞脆性试验检查，必要时进行基因诊断，以及建档追踪产前检测，以达到减少出生缺陷，提高出生人口质量目的。

参考文献

[1]杜传书  地中海贫血研究的现状与未来  中华医学遗传学杂志1996.13(5)257

[2]亦逵  广东省地中海贫血的研究现状与展望[J]，广东医学杂志  1998.19(4):243

[3]徐群清、潘红飞、梁峰等轻型地贫简易筛查方法研究，右江民族医学院学报  2002，24(6):826-827

[4]Huisman THJ, Carver MFH, Baysal E. A Syssabus of Thalassemia Mutations. The Sickled Cell Anemia Foundation in Augusta, GA, USA. 1997

[5]FujitaS. Congenitalhemolytic anemia – hemoglobin abnormality – thalassemia. Nippon Rinsho. 1996;54 ( 9 ):

[6]Olivieri NF. The β- thalassemia. N Engl J Med. 1999; 341( 2 ):99-109

[7]Tunaci M, Trnaci A , Egnic G , et al . Imaging fratures of thalassemia. Eur Radiol. 1999; 9 ( 9 ) :1804 - 9.

[8]Clarke GM , Higgins – TN. Lanboratory investigation of date. Clin Chen. 2000:46 ( 8pt 2 ) :1284 – 90

[9]Weatherall DJ. Pathophysiology of thalassaemia. Baillieres Chin Haematol. 1998 ; 11 ( 1 ) :127 – 46.

[10]Ko TM , Xu X. Molecular study and prenatal diagnosis of alpha and beta – thalassemias in Chinese. J Formos Med Assoc. 1998; 97 ( 1 ):5-15.

[11]陆小婵、卢冬、罗斌、吴惠珍、地中海贫血产前筛查循征检验、中国优生与遗传杂志，2006.14（3）264

[12]陈洁、李惠敏、柯晓燕，应用不同方法在婚检中进行地中海贫血初筛及确诊的研究，中医医学实践杂志，2005.6 。