长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）是一类转录长度大于200个核苷酸的非编码RNAs^[1]。近年来人们通过一系列的研究发现lncRNAs参与生物体内重要的生命过程，如调节基因表达、RNA剪切、配体受体结合等最基本的生化过程和细胞内反应^[2]。至今为止，HOTAIR已被证明在多种恶性肿瘤中表达显著升高，说明其与肿瘤细胞侵袭、转移等恶性生物学行为密切相关。多梳蛋白抑制复合体2(polycomb repressive complex2，PRC2) 是H3组蛋白第27位赖氨酸 (histone H3 lysine K27，H3K27)主要甲基化转移酶，是负责H3K27三甲基化的复合物，其核心成分包括EZH2，SUZ12,EED^[3]。PRC2 能通过组蛋白的甲基化作用来沉默抑癌基因，促进癌症转移。我们通过干涉HOTAIR基因来研究其对PRC2 成分EZH2与SUZ12蛋白表达的影响，为探讨子宫内膜癌的基因治疗提供新思路。

1材料和方法

1.1材料Ishikawa 细胞由本室保存并常规培养; RPMI1640培养基购自Gibco 公司; 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司; TRIzol Reagent 和脂质体Lipofect3000购自Invitrogen 公司; 干涉序列由上海上海生工生物工程有限公司合成; NC膜ECL 化学发光试剂购自Thermo公司;EZH2、SUZ12抗体购自Abcam 公司; Western blot 蛋白预染Marker 购自Bio-Rad公司; PrimeScript反转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq购自Promega公司

1.2方法 细胞培养 Ishikawa 细胞用含10% 胎牛血清、100U/L 青霉素和100U/L 链霉素双抗的ＲPMI-1640 培养液，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。每1 -2天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80% -90%时进行传代培养。

1.2.1转染 将细胞培养于6 孔板，以只转染脂质体为阴性对照组，100nmol /L 浓度为实验组，每组平行3 孔，按LipofectamineTM3000说明书依次转染，HOTAIRsiRNA的靶序列为( Sense:5'-GAACGGGAGUACAGAGAGAUU-3') 转染后48h 收集各组细胞用于qPCR分析。

1.2.2 qPCR 检测各组HOTAIR 基因表达转染36 h 后从MDA-MB-231 细胞提取总RNA，反转录为cDNA。以F1( GGTAGAAAAAGCAACCACGAAGC)R1( ACATAAACCTCTGTCTGTGAGTGCC)为HOTAIR 引物，F2( GCTGAGAACGGGAAGCTTGT)，R2( GCCAGGGGTGCTAAGCAG) 为GAPDH 引物进行qPCR。qPCR 反应条件: 94℃ 30s， 95℃ 1min,55℃30s,95℃30s然后94℃5s,60℃30s，40个循环。

1.2.3 Western blot 检测目的蛋白的表达转染48 h 后提取Ishikawa 细胞总蛋白质，用BCA 试剂盒进行蛋白定量; 根据目的蛋白分子量配制12 g /L 的SDS-PAGE 分离胶，常规电泳分离蛋白，然后将蛋白转移至NC 膜，50 g /L 脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入兔抗人EZH2 抗体( 1∶500)或SUZ12( 1∶1 000)室温摇床温育1 h 后4℃冰箱过夜; 一抗处理后用 TBST 洗膜3 次，每次10 min，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体( 1 ∶ 4 000) ，室温摇床温育30 min 后以TBST 洗膜3 次，每次10 min，用ECL化学发光显影。PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色，采用自动凝胶成像系统成像,以Tanon5200软件对蛋白印迹条带进行处理和分析。

2结果

2.1 qPCR检测各处理组HOTAIR的表达 阴性对照组只加脂质体，转染组采用100nmol /L 的转染浓度进行干涉。阴性对照组HOTAIR 基因表达水平明显高于转染组,( P ＜ 0.05，) ,说明干涉效果明显。

2.2 EZH2蛋白的表达

阴性对照组只加脂质体，转染组采用100nmol /L 的转染浓度进行干涉。 HOTAIR-siRNA转染可明显抑制模型细胞中EZH2蛋白表达。

2.3 SUZ12蛋白的表达

阴性对照组只加脂质体，转染组采用100nmol /L的转染浓度进行干涉。 HOTAIR-siRNA转染可明显抑制模型细胞中SUZ12蛋白表达。