孟盈盈1,2，林敬1,2，张政2，吕英涛1*，林学政2*
（1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；
2. 国家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物质重点实验室，山东 青岛 266061）
摘 要：我国北方地区冬季污水的生物处理存在着处理不彻底、效率低和出水水质难以达标等难题。根据菌落形态特征，利用反硝化细菌培养基从26个站位的北极海洋沉积物样品中经富集培养与分离纯化，获得了克隆到16S rRNA基因有效序列的菌株达59株；基于16S rRNA基因的相似性分析与系统发育研究结果表明，分离到的菌株分属于细菌域的3个门、4个纲、8个目、13个科、16个属、23个种，其中γ-Proteobacteria占大多数（57.63%）；有1株菌与模式菌株的16S rRNA基因序列相似性小于97%，可能代表潜在的新种。大部分菌株（95%）的温度和耐NaCl浓度的生长范围分别为0–30 ℃和0–60‰，具有产硝酸盐还原酶、蛋白酶和α-葡萄糖苷酶等胞外水解酶和利用葡萄糖、阿拉伯糖和甘露醇等多种碳源生长的能力；利用简并引物从菌株Pseudomonas sp. C22-DN-54、Pseudomonas sp. P13-DN-7、Marinobacter sp. P12-DN-1和Pseudomonas sp. E24-DN-52克隆到了亚硝酸盐还原酶基因（nirS）。本研究将为北方寒冷地区的低温污水生物处理提供新的菌种资源。（图2表5）
关键词：北极海洋沉积物；低温；反硝化细菌；系统发育分析
Analysis of Diversity of Cold-Adapted Denitrifying Bacteria Isolated from Arctic Ocean Sediments
MENG Yingying 1,2, LIN Jing 1,2, ZHANG Zheng 2, LV Yingtao 1 *, LIN Xuezheng 2 *
1. College of Marine Science and Biotechnology, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, Shandong, China;
2.Key laboratory of Marine Bioactive Substances, the First Institute of Oceanography, SOA, Qingdao 266061, Shandong, China
Abstract:
In the northern areas of China, biotreatment techniques of waste water at low temperatures have some shortcomings, such as not thorough treatment, low efficiency and difficulties in achieving emission standards in the winter. On the basis of morphological characters, a total of 59 isolates with valid 16S rRNA gene sequences were obtained from the 26 Arctic Ocean sediments by denitrifying screening medium. Molecular identification and phylogenetic analysis on the basis of 16S rRNA gene sequences showed that these isolates belonged to 3 phyla, 4 classes, 8 orders, 13 families, 16 genera and 23 species, respectively in the bacteria domain; among which, γ-Proteobacteria accounted for the majority (57.63%). One isolate having 16S rRNA gene similarity less than 97% with the closest type strain might be novel species. The growth temperature and NaCl tolerance range of most representative strains was 0–30 ℃ and 0–90‰, respectively. These isolates could produce various extracellular enzymes including nitrate reductase, protease and α-glucosidase, and could grow by utilizing many kinds of carbon sources such as glucose, arabinose and mannitol. Nitrite reductase gene (nirS), the key enzyme gene in the denitrification, was cloned from strain Pseudomonas sp. C22-DN-54, Pseudomonas sp. P13-DN-7, Marinobacter sp. P12-DN-1 and Pseudomonas sp. E24-DN-52 respectively by the degenerate primers. The research will provide new microbial resources for the sewage treatment at low temperature in cold northern areas. (Figure 2 Table 5)
Key words: Arctic Ocean sediments; low temperature; denitrifying bacteria; phylogenetic analysis
随着我国经济和社会的快速发展，工业污水和生活污水的排放量不断加大，水污染严重影响了氮循环，打乱了生态系统的平衡[1]。现阶段，生物脱氮技术在污水脱氮处理中的应用最为普遍，而其中中温菌占大多数。大量研究表明，目前作为脱氮剂使用的多数反硝化细菌，其最适生长温度为25–40 ℃[2]。张玉芹等[3]通过对45株反硝化细菌的培养条件进行研究，筛选到反硝化作用比较强的菌株B88和B237，其最适生长温度为30 ℃。郭岩等[4]研究表明，从天津碱厂污泥中分离到的高效嗜碱好氧反硝化细菌BME1的最适脱硝温度为37 ℃。Zeng et al.[5]从乡镇水产养殖的水体、菜地及污染严重的地域的土壤中分离得到具有显著脱氮能力的菌株A13，其最适生长温度为32.5 ℃。而在我国广大的北方地区，冬季低温会降低活性污泥的吸附性能以及沉降性能，影响微生物的生长发育等[6–7]，导致低温条件下微生物处理出现处理效果差、污水难以达标排放等问题。因此，寻找低温条件下对污水处理效果较好的微生物至关重要。
极地气候寒冷，地理位置非常独特，是微生物新菌种资源的宝库，具有潜在的研究和应用价值[8]。海洋沉积物的氮循环在全球生物地球化学循环中占45%[9]。氮循环是靠多种微生物共同起作用维持的，如硝化细菌、反硝化细菌、氨氧化细菌等[10–11]。Rysgaard et al.[12]通过对北极格陵兰岛东、西海岸沉积物中反硝化细菌的活性进行研究，结果显示在-1.7–4 ℃时，反硝化细菌的氮气产量为33–265 μmol N·m–2·d–1。张海舟等[13]通过对楚科奇海沉积物间隙水等的营养盐的研究表明楚科奇海沉积环境具有很强的反硝化过程。Bo and Dalsgaard[14]研究也表明，海洋沉积物中的厌氧氨氧化细菌对氮气的产量有着重大的贡献。
反硝化细菌主要通过反硝化作用，将污水中的硝态氮去除。反硝化作用是在反硝化酶系的作用下，以硝酸盐为最终电子受体，使硝酸盐逐步还原为NO2–、NO、N2O，最终转变为N2的过程[15]。亚硝酸还原酶是反硝化作用的关键酶基因，包括血红素亚硝酸还原酶（细胞色素cd1）和铜型亚硝酸盐还原酶，二者分别由nirS[16]和nirK[17]编码。目前，反硝化细菌研究主要集中在陆地之上，而对拥有丰富菌种资源的海洋的研究较少。本文通过利用反硝化细菌筛选培养基从北极海洋沉积物中富集与筛选低温反硝化细菌，研究其多样性、温度和NaCl浓度适应范围，关键酶基因克隆以及生化特性等，以期为北方地区寒冷季节低温生活污水的生物处理提供新的菌种资源和基础资料。